<ㄱㅇㅅㅎ> 실험 3: 세포배양 및 독성평가(MTT assay)_보충공부

- 계대배양

: 원래 배양물에서 일부 세포를 새로운 배양 배지로 옮겨서 만들어진 새로운 세포 또는 미생물을 배양하는 것

: 1) 세포의 수를 늘리는데 사용되거나 2) 세포주들을 오랫동안 유지하기 위해 수명을 연장하는 데 사용

: 식물 분갈이 하는 느낌..

: 부착형 세포들이 계속 자라다가 바닥면을 꽉 채우게 되어 서로서로 맞닿아 생장할 공간이 없게 되면 접촉으로 인한 "생장 저해(contact inhibition of proliferation)현상"이 일어나게 됨(세포 성질 변할 수 있음) > 공간부족 방지를 위해 계대 배양

  + Cell lifter을 이용해 물리적으로 긁어내는 방법: 세포에 손상을 가할 수 있음 / 세포를 생장시킬 필요가 없을 때 이용<ex. 세포 파괴해서 그 내부의 물질 얻어낼 때>

 

- 세포의 종류: 부착성(adherent) vs 부유성(suspension)

* 많은 세포들이 부착성 세포<ex. 혈관 내피 세포(endothelial cell)>

: 플라스틱 세포 배양 용기 안쪽 바닥면에 붙어 세포배양액(=액체 배지, 배지)에 들어있는 포도당을 비롯한 영양분을 활용하여 생장

: (세포 표면) 부착 단백질<ex. 인테그린(integrin)> + (세포 외부) 세포 외 기질 단백질(ECM, extracellular matrix protein) <ex. fibronectin, collagen>

 >>> 부착해 있게 되는 거

 

- 세포 연접(cell junction)

: 세포들끼리 서로 달라붙는 경우

: 캐드히린(cadherin) 단백질이 그 연결다리 역할 - 활성에 칼슘이온 필요(EDTA 관련)

- 세포배양 시 주의점

: 세포배양 시에는 오염에 가장 주의하며 작업을 진행해야 함

  오염물질에는 미생물, 바이러스, 곰팡이, 균주 등이 있고 세포시험을 진행할 때에는 멸균작업이 완료된 소모품을 사용하고 장갑을 필수로 껴서 소독을 완료한 후 시험을 진행함

 

- MTT assay

: 세포의 생존율을 측정하는 방법 <MTT, MTS, WST-1>

: 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)의 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT를 보라색을 띄는 비수용성의 formazan 결정으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용한 검사법

 

- 재료 및 기구

* 코니칼튜브(conical tube): 소분계량용기

* DPBS

: 주로 세포배양시 워싱을 할 때 가장 많이 사용하는 시약

: 워싱과정에서 떨어져나가는 세포는 이미 죽은 세포일 확률 높음

* Trypsin

: 단백질 소화효소

: 세포 부착 및 연접(cell junction)에 이용되는 단백질을 끊어주되, 세포막을 이루는 인지질에는 손상을 입히지 않기 위해 사용됨

: 너무 오랜 기간 동안 노출시키는 것은 안 좋음(부착 및 연접 단백질도 세포 생리 및 신호 전달 기전에 관여)

+ 세포 떼어내고 나서 FBS(Alpha-1 antitrypsin 같은 단백질 들어있음)가 포함된 배양액을 넣어주면 트립신 계속적으로 활동하는 것 막음

* EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)

: 칼슘 이온을 붙잡아두는 화합물

: integrin(부착단백질), cadherin(연접 단백질)은 활성을 위해 칼슘 이온 필요함 / 근데 EDTA가 칼슘 이온 붙잡고 있으면 단백질 기능이 방해가 되겠지요

* 트리판 블루(trypan blue)

: cell count할 때 주로 사용하는 염색시약

* BCS(bovine calf serum) free medium

* DMSO: 생성된 crystal을 녹여 청자색 용액으로 만들고 이 용액의 흡광도를 측정하여 cell viability 계산

 

 

<참고자료 및 사이트>

https://blog.naver.com/withcoffee67/222359654915

[세포 생물학/실험] 트립신(Trypsin)-EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)의 작용 원리 (+ 플라스틱 세포 배

https://jonlieffmd.com/blog/extra-cellular-matrix-is-critical-to-neuroplasticity

Extra Cellular Matrix Is Critical to Neuroplasticity

https://www.youtube.com/watch?v=ptNTF2oM7xo 

https://www.youtube.com/watch?v=Z9TS9nmp7Uk